La sistemina è un noto ormone peptidico vegetale che svolge un ruolo cruciale nella risposta di difesa della pianta contro erbivori e agenti patogeni. In qualità di fornitore leader di Systemin, capire come rilevare la Systemin nelle piante è della massima importanza, non solo per la ricerca scientifica ma anche per garantire la qualità e l'autenticità dei prodotti Systemin che offriamo. In questo blog esploreremo vari metodi per rilevare la sistemina nelle piante, approfondendo i principi scientifici alla base di ciascun approccio.
1. Metodi di rilevamento immunologico
Le tecniche di rilevamento immunologico sono ampiamente utilizzate per rilevare la sistemina nelle piante grazie alla loro elevata specificità e sensibilità. Questi metodi si basano sull'uso di anticorpi che riconoscono e si legano specificamente alla sistemina.
Saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA)
ELISA è un metodo immunologico comunemente impiegato. Si tratta di rivestire una micropiastra con un anticorpo specifico per la sistemina. Gli estratti vegetali vengono quindi aggiunti ai pozzetti della micropiastra. Se la sistemina è presente nell'estratto, si legherà all'anticorpo immobilizzato. Successivamente viene aggiunto un secondo anticorpo coniugato con un enzima. Questo anticorpo secondario si lega anche alla sistemina. Dopo aver lavato via eventuali sostanze non legate, viene aggiunto un substrato per l'enzima. La reazione enzima-substrato produce un segnale rilevabile, spesso un cambiamento di colore, che può essere misurato fotometricamente. L'intensità del segnale è proporzionale alla quantità di sistemina nel campione.
I vantaggi dell'ELISA includono l'elevata sensibilità, la capacità di elaborare più campioni contemporaneamente e la relativa facilità d'uso. Tuttavia, richiede la produzione di anticorpi di alta qualità e la reattività crociata con altri peptidi nell'estratto vegetale a volte può rappresentare un problema.
Western Blot
Il Western blotting è un’altra potente tecnica immunologica. Innanzitutto, le proteine vegetali vengono estratte e separate mediante elettroforesi su gel in base al loro peso molecolare. Le proteine separate vengono poi trasferite su una membrana. Un anticorpo specifico per la Systemina viene incubato con la membrana. Dopo il lavaggio, viene aggiunto un anticorpo secondario coniugato con un reagente di rilevamento (come un marcatore fluorescente o chemiluminescente). La presenza di sistemina viene visualizzata come una banda distinta sulla membrana.
Il Western blotting consente la determinazione del peso molecolare della sistemina e può fornire informazioni sulle sue possibili modificazioni. Tuttavia, è più dispendioso in termini di tempo e tecnicamente rispetto all'ELISA.
2. Rilevazione basata sulla spettrometria di massa
La spettrometria di massa (MS) è un metodo estremamente accurato e versatile per rilevare la sistemina nelle piante. Può identificare e quantificare i peptidi in base al loro rapporto massa/carica (m/z).
Cromatografia liquida - Spettrometria di massa (LC - MS)
Nella LC - MS, gli estratti vegetali vengono prima separati mediante cromatografia liquida. I componenti separati vengono quindi introdotti in uno spettrometro di massa. Lo spettrometro di massa ionizza le molecole e misura i loro valori m/z. Confrontando i valori m/z ottenuti con i valori m/z teorici della sistemina, è possibile confermare la presenza della sistemina.
LC - MS offre un'elevata risoluzione e la capacità di rilevare la sistemina anche in matrici vegetali complesse. Può anche fornire informazioni sulla struttura e sulle possibili modifiche post-traduzionali della sistemina. Tuttavia, richiede attrezzature costose e personale altamente qualificato.
Spettrometria di massa tandem (MS/MS)
MS/MS è un'estensione della spettrometria di massa. Dopo l'analisi di massa iniziale nel primo spettrometro di massa, gli ioni selezionati vengono frammentati e i frammenti vengono analizzati in un secondo spettrometro di massa. Ciò consente la determinazione della sequenza aminoacidica della sistemina, essenziale per confermarne l'identità.
MS/MS è particolarmente utile quando si ha a che fare con campioni in cui potrebbero essere presenti peptidi isobarici o isomerici che potrebbero interferire con l'identificazione. Fornisce informazioni strutturali dettagliate sulla sistemina, ma è anche più complessa e richiede tempo rispetto alla spettrometria di massa a stadio singolo.
3. Rilevazione basata sulla biologia molecolare
Le tecniche di biologia molecolare possono essere utilizzate anche per rilevare la sistemina a livello di espressione genica.
Trascrizione inversa - Reazione a catena della polimerasi (RT - PCR)
RT - PCR viene utilizzata per rilevare l'mRNA che codifica per la sistemina. Innanzitutto, l'RNA totale viene estratto dai tessuti vegetali. L'mRNA viene quindi trascritto al contrario nel DNA complementare (cDNA) utilizzando la trascrittasi inversa. Primer specifici per il gene Systemin vengono utilizzati per amplificare il cDNA mediante PCR. I frammenti di DNA amplificati possono essere visualizzati mediante elettroforesi su gel.
La RT - PCR consente di rilevare l'espressione del gene della sistemina, che può indicare lo stato fisiologico della pianta in termini di risposta di difesa. Tuttavia fornisce solo informazioni sulla potenziale produzione di sistemina a livello trascrizionale e non misura direttamente la presenza del peptide stesso.
PCR quantitativa in tempo reale (qRT - PCR)
qRT - PCR è una versione più avanzata di RT - PCR. Consente la quantificazione della quantità di mRNA della sistemina nel campione. Durante la reazione PCR, viene utilizzato un colorante fluorescente o una sonda marcata con fluorescenza per monitorare l'amplificazione in tempo reale. Il ciclo in cui il segnale di fluorescenza attraversa una soglia (valore Ct) è inversamente proporzionale alla quantità di mRNA target.
qRT - PCR fornisce una quantificazione più accurata dell'espressione genica della sistemina rispetto alla tradizionale RT - PCR. È utile per studiare la regolazione della produzione di sistemina in risposta a diversi stimoli.
4. Rilevazione basata su test biologici
I test biologici si basano sull'attività biologica della sistemina per rilevarne la presenza. Ad esempio, è noto che la sistemina induce la sintesi degli inibitori della proteasi nelle piante. È possibile impostare un test biologico trattando i tessuti vegetali con un campione sospettato di contenere sistemina e quindi misurando l'induzione degli inibitori della proteasi.
Il vantaggio dei test biologici è che misurano direttamente l'attività biologica della sistemina. Tuttavia, sono meno specifici rispetto ad altri metodi e possono essere influenzati da altri fattori presenti nell’estratto vegetale che possono influenzare anche la sintesi degli inibitori della proteasi.
Conclusione
In qualità di fornitore di Systemin, comprendiamo l'importanza di un rilevamento accurato e affidabile di Systemin. Ciascuno dei metodi sopra descritti presenta vantaggi e limiti. I metodi immunologici sono altamente specifici e sensibili, la spettrometria di massa fornisce informazioni strutturali dettagliate, le tecniche di biologia molecolare offrono approfondimenti sull'espressione genica e i test biologici misurano l'attività biologica. In pratica, una combinazione di questi metodi può essere utilizzata per garantire il rilevamento e la quantificazione accurati della sistemina nelle piante.
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Riferimenti
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- Schilmiller, AL e Howe, GA (2005). Sistemina: un segnale polipeptidico per le risposte difensive delle piante. Biologia attuale, 15(18), R744 - R747.
- van der Hoorn, RA, e Jones, JD (2004). Le proteasi nella difesa dai patogeni. Opinione attuale in biologia vegetale, 7(4), 400 - 406.