Cos'è la sintesi peptidica

 

La sintesi dei peptidi è un campo attivo nella chimica delle proteine ​​e dei peptidi, che tipicamente comporta l'aggiunta sequenziale di amminoacidi in un ordine definito per formare la catena peptidica mediante metodi chimici. I principali metodi di sintesi sono la sintesi in fase liquida e in fase solida. Rispetto a LPPS, SPPS presenta i vantaggi di essere più veloce, più semplice, con meno reazioni collaterali e rese più elevate.

 

Metodo SPPS standard, comprese le strategie Boc (benzile) e Fmoc (tBu).

 

 

Strategia Boc (benzile).

In questo approccio di sintesi, le resine di polistirene clorometilato, idrossimetilato e p-metossibenzile (PMA) vengono utilizzate come supporti solidi. Il gruppo -ammino è protetto con t-butossicarbonile (Boc), mentre i gruppi a catena laterale degli aminoacidi sono protetti con derivati ​​benzilici. Il gruppo Boc viene rimosso utilizzando TFA puro o TFA in CH2Cl2 e, al termine della sintesi, i gruppi protettivi della catena laterale e i collegamenti peptide-resina vengono rimossi con un acido forte come l'acido fluoridrico anidro (HF) o TFMSA.

 

Strategia Fmoc (tBu).

In questo approccio di sintesi, la resina Wang, la resina 2-Chlorotrityl Chloride Resin, la resina Rink amide-AM, le resine Rink amide-MBHA vengono utilizzate come supporti solidi. Il gruppo amminico è protetto con 9-fluorenilmetossicarbonile (Fmoc ), mentre i gruppi della catena laterale degli amminoacidi sono protetti con gruppi protettivi acido-labili. Il gruppo Fmoc viene rimosso utilizzando piperidina al 20% in DMF e, al termine della sintesi, i gruppi protettivi della catena laterale e i collegamenti peptide-resina vengono rimossi con TFA all'1%-95%. Fmoc SPPS è attualmente il metodo preferito per la sintesi dei peptidi.

 

Principi di base della sintesi dei peptidi in fase solida Fmoc

 

Scegli la resina

Le resine più utilizzate in Fmoc SPPS, tra cui la resina 4-alcool alcossibenzilico (Wang), 2-resina cloruro di clorotritile, resina Rink Amide, resine Rink Amide-MBHA. Le resine ammidiche vengono utilizzate per la sintesi di peptidi con l'ammidazione C terminale richiesta. La resina Wang e la resina 2-Cl Trt sono comunemente utilizzate per la sintesi del peptide con COOH libero terminale C richiesto. Ma quando il C-terminale del peptide ha Pro e Gly come primo amminoacido, la resina Wang non deve essere utilizzata a causa del rischio di formazione di DKP (dichetopiperazina), si consiglia l'uso della resina 2-Chlorotrityl Chloride.

 

 

Attacco di amminoacidi protetti alle resine

Il primo amminoacido Fmoc è attaccato ad una resina di supporto insolubile tramite un legante acido labile.

 

Deprotezione del gruppo protettivo -ammino

Il gruppo protettivo temporaneo Fmoc all'N-terminale della resina peptidilica viene rimosso trattandolo con una soluzione di piperidina al 20% in DMF. Questa reazione di solito termina entro 10-20 minuti.

 

Fasi di lavaggio

Dopo ogni reazione chimica, vengono eseguite fasi di lavaggio per rimuovere dalla resina i reagenti, i sottoprodotti e le molecole non reagite in eccesso. Ciò aiuta a mantenere la purezza della catena peptidica in crescita.

 

Attivazione e accoppiamento dell'amminoacido protetto

L'amminoacido protetto legato alla resina viene attivato per aumentare la sua reattività per l'accoppiamento con l'amminoacido successivo nella sequenza. Gli agenti attivanti comuni includono HOAt, HOBt, PyBOP, PyAOP, HBTU e HATU. L'accoppiamento comporta la formazione di un legame peptidico tra l'amminoacido attivato e il gruppo amminico della catena peptidica in crescita. Un test Kaiser viene generalmente utilizzato per monitorare la completezza delle reazioni di accoppiamento.

 

Fasi di lavaggio

Similmente alle fasi di lavaggio precedenti, ciò garantisce la rimozione dei reagenti e dei sottoprodotti in eccesso dopo la reazione di accoppiamento.

 

Scissione dalla resina e deprotezione dei gruppi protettori della catena laterale

Una volta che la sequenza peptidica desiderata è stata sintetizzata sulla resina, questa viene scissa dal supporto solido utilizzando un cocktail di scissione come l'acido trifluoroacetico (TFA) contenente scavenger come tioanisolo e acqua. Contemporaneamente, i gruppi protettivi della catena laterale sui residui di amminoacidi vengono rimossi, rivelando il peptide completamente deprotetto, pronto per la purificazione e l'analisi.