Ehilà! Sono un fornitore di celle TET - 213 e oggi ti guiderò attraverso come eseguire la colorazione dell'immunofluorescenza su queste cellule. La colorazione dell'immunofluorescenza è una tecnica super utile nel mondo della biologia cellulare. Ci aiuta a visualizzare proteine specifiche all'interno delle cellule, dandoci una migliore comprensione delle loro funzioni e posizioni.
Preparazione del tet - 213 cellule
Per prima cosa, dobbiamo preparare le nostre celle TET - 213. Inizia coltivandoli in un mezzo di coltura appropriato. Queste cellule di solito funzionano bene in un mezzo come RPMI 1640 integrato con siero bovino fetale al 10% (FBS) e 1% di penicillina - streptomicina. Incubare le cellule a 37 ° C in un'atmosfera CO₂ del 5%.
Una volta che le cellule raggiungono circa il 70 - 80% di confluenza, è tempo di iniziare il processo di colorazione. Dovrai seminare le celle sui vetrini in una piastra da 24 anni. Ciò semplifica la gestione delle cellule durante le fasi di colorazione. Utilizzare una pipetta per trasferire attentamente la sospensione cellulare sui vetrini. Assicurati di distribuire uniformemente le celle.
Fissare le celle
Dopo che le celle si sono attaccate ai vetrini (di solito dopo 24 ore), è tempo di ripararle. La fissazione è cruciale in quanto conserva la struttura cellulare e mantiene le proteine in posizione. È possibile utilizzare un fissativo come il paraformaldeide al 4% (PFA) in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). Aggiungi abbastanza PFA per coprire le celle sui vetrini e lasciarlo riposare a temperatura ambiente per circa 15-20 minuti.
Una volta terminata la fissazione, lavare le cellule tre volte con PBS. Ogni lavaggio dovrebbe durare per circa 5 minuti. Questo aiuta a rimuovere qualsiasi fissativo in eccesso dalle celle.
Permeabilizzazione
Il prossimo è la permeabilizzazione. Questo passaggio consente agli anticorpi di entrare nelle cellule e legarsi alle proteine bersaglio. Utilizzare un agente permeabilizzante come lo 0,1% di Triton X - 100 in PBS. Aggiungere la soluzione di permeabilizzazione alle cellule e lasciarla incubare a temperatura ambiente per circa 10 minuti.
Successivamente, lavare le cellule tre volte con PBS di nuovo, proprio come nel passaggio precedente. Ciò garantisce che l'agente permeabilizzante sia completamente rimosso.
Blocco
Il blocco è un passo importante per prevenire il legame non specifico degli anticorpi. È possibile utilizzare una soluzione di blocco come l'albumina sierica bovina al 5% (BSA) in PBS. Aggiungi la soluzione di blocco alle celle e lascia che incuba a temperatura ambiente per circa 1 ora.
Incubazione di anticorpi primari
Ora è il momento di aggiungere l'anticorpo primario. L'anticorpo primario è specifico per la proteina che si desidera rilevare nelle cellule TET - 213. Diluire l'anticorpo primario nella soluzione di blocco secondo le istruzioni del produttore.
Rimuovere con cura la soluzione di blocco dalle cellule e aggiungere l'anticorpo primario diluito. Assicurati di coprire completamente le cellule con la soluzione anticorpale. Incubare le cellule con l'anticorpo primario durante la notte a 4 ° C. Questo lungo tempo di incubazione consente all'anticorpo di legarsi efficacemente alla proteina bersaglio.
Il giorno successivo, lavare le cellule tre volte con PBS, con ogni lavaggio della durata di circa 5 minuti. Questo si sbarazza di qualsiasi anticorpo primario illimitato.
Incubazione di anticorpi secondari
Dopo l'incubazione dell'anticorpo primario, è tempo per l'anticorpo secondario. L'anticorpo secondario è etichettato con un colorante fluorescente, che ci consente di visualizzare la proteina target sotto un microscopio a fluorescenza.
Diluire l'anticorpo secondario nella soluzione di blocco secondo le istruzioni del produttore. Rimuovere il PBS dalle cellule e aggiungere l'anticorpo secondario diluito. Incubare le celle a temperatura ambiente per circa 1-2 ore al buio. L'ambiente oscuro è importante per prevenire lo sbiadimento del colorante fluorescente.
Una volta che l'incubazione è finita, lava le cellule tre volte con PBS, proprio come prima.
Controcolorante
La controcolive viene utilizzata per visualizzare i nuclei cellulari. Puoi usare un colorante come DAPI (4 ', 6 - Diamidino - 2 - fenilindolo). Diluire DAPI in PBS e aggiungerlo alle celle. Lascialo incubare a temperatura ambiente per circa 5 minuti.
Successivamente, lavare ancora una volta le cellule con PBS per rimuovere qualsiasi DAPI in eccesso.
Montaggio
Infine, è il momento di montare i vetrini su vetrini per microscopi. Usa un mezzo di montaggio, che aiuta a mantenere le cellule in posizione e preserva anche la fluorescenza. Posizionare con cura una goccia di mezzo di montaggio su una diapositiva per microscopi e quindi invertire il vetrino sulla goccia. Assicurati che non ci siano bolle d'aria intrappolate tra il vetrino e la diapositiva.
Imaging
Ora sei pronto a immaginare le cellule al microscopio a fluorescenza. Utilizzare i filtri appropriati per visualizzare i segnali fluorescenti dall'anticorpo secondario e dal DAPI. Puoi scattare più immagini in diversi campi di vista per ottenere una buona rappresentazione delle celle.
Utilizzando peptidi correlati nel processo
Durante la coltura cellulare e il processo di colorazione, potresti anche trovare utili alcuni peptidi. Per esempio,(Gly14) -umanina (umano)ha dimostrato di avere alcuni effetti benefici sulla vitalità e la funzione cellulare. Puoi aggiungerlo al terreno di coltura per vedere se influisce sull'espressione proteica che stai studiando nelle cellule TET - 213.
Peptide di fibronectina CS1Può essere utilizzato per ricoprire i vetrini prima di seminare le cellule. Ciò può migliorare l'attacco e la diffusione delle cellule, rendendo il processo di colorazione più efficiente.
Endotelina - 1 (11 - 21)Potrebbe anche svolgere un ruolo nelle vie di segnalazione all'interno delle cellule Tet - 213. Puoi aggiungerlo al terreno di coltura e quindi studiare come influisce sull'espressione della proteina target attraverso la colorazione dell'immunofluorescenza.
Conclusione
L'esecuzione della colorazione dell'immunofluorescenza sulle cellule TET - 213 può essere un po 'complicato, ma se segui attentamente questi passaggi, dovresti essere in grado di ottenere ottimi risultati. È una tecnica potente che può darti preziosi approfondimenti sulla biologia di queste cellule.
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Riferimenti
- Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K. e Walter, P. (2002). Biologia molecolare della cellula. Scienze della ghirlanda.
- Pollard, TD e Earnshaw, WC (2004). Biologia cellulare. Saunders.