La trasfezione è una tecnica cruciale nella biologia molecolare che consente l'introduzione di acidi nucleici estranei nelle cellule, consentendo ai ricercatori di studiare la funzione genica, l'espressione proteica e le vie di segnalazione cellulare. Le cellule TET-213, una linea cellulare di neuroblastoma umano, sono comunemente usate nella ricerca sulle neuroscienze a causa delle loro proprietà neuronali. In questo post sul blog, condividerò alcune intuizioni su come trasfettare efficacemente le celle TET-213, attingendo alla mia esperienza come fornitore di cellule TET-213.
Comprensione delle cellule TET-213
Prima di approfondire il processo di trasfezione, è importante comprendere le caratteristiche delle cellule TET-213. Queste cellule sono derivate da un neuroblastoma umano e presentano caratteristiche neuronali come la capacità di estendere i neuriti ed esprimere marcatori neuronali. Sono cellule aderenti che crescono bene in condizioni di coltura cellulare standard, in genere in un mezzo integrato con siero bovino fetale (FBS) e antibiotici.
Scegliere il metodo di trasfezione giusto
Esistono diversi metodi disponibili per la trasfettazione delle celle, ognuna con i propri vantaggi e limitazioni. La scelta del metodo di trasfezione dipende da vari fattori, incluso il tipo di acido nucleico da trasfettare, il tipo di cellula e l'efficienza di trasfezione desiderata. Ecco alcuni metodi di trasfezione comuni adatti alle cellule TET-213:
Trasfezione a base di lipidi
La trasfezione a base di lipidi è uno dei metodi più utilizzati per introdurre acidi nucleici in cellule. Implica l'uso di reagenti a base di lipidi che formano complessi con l'acido nucleico, che vengono quindi assorbiti dalle cellule attraverso l'endocitosi. La trasfezione a base di lipidi è relativamente facile da eseguire e può ottenere elevate efficienze di trasfezione in molti tipi di cellule, comprese le cellule TET-213.
Elettroporazione
L'elettroporazione è un metodo fisico che utilizza un campo elettrico per creare pori temporanei nella membrana cellulare, consentendo all'acido nucleico di entrare nelle cellule. Questo metodo è particolarmente utile per la trasfettazione di cellule che sono difficili da trasfettare usando altri metodi, come le cellule primarie. Tuttavia, l'elettroporazione può essere più dannosa per le celle e può richiedere l'ottimizzazione dei parametri di elettroporazione per ottenere elevate efficienze di trasfezione.
Trasduzione virale
La trasduzione virale comporta l'uso di vettori virali per consegnare l'acido nucleico nelle cellule. I vettori virali sono derivati da virus che sono stati progettati per trasportare l'acido nucleico desiderato e possono infettare in modo efficiente le cellule. La trasduzione virale può ottenere elevate efficienze di trasfezione e può essere utilizzata per trasfettare una vasta gamma di tipi di cellule, comprese le cellule TET-213. Tuttavia, la trasduzione virale richiede attrezzature e competenze specializzate e vi sono potenziali problemi di sicurezza associati all'uso di vettori virali.
Preparare le cellule per la trasfezione
La corretta preparazione delle cellule è essenziale per la trasfezione di successo. Ecco alcuni passaggi da seguire quando si preparano le cellule TET-213 per la trasfezione:
Coltura cellulare
Mantenere le cellule TET-213 in un mezzo di coltura cellulare adatto integrato con FBS e antibiotici. Passaggio regolarmente le cellule per mantenere la loro fase di crescita esponenziale. È importante usare cellule sane e attivamente in crescita per la trasfezione, poiché le cellule in uno stato fisiologico scarso possono avere efficienze di trasfezione più basse.
Seeding cellulare
Seed le cellule TET-213 in un piatto di coltura o una piastra multi-pozzo a una densità adeguata. La densità di semina dipende dal metodo di trasfezione e dal tipo di esperimento. Per la trasfezione a base di lipidi, si consiglia in genere una densità di semina della confluenza del 50-80%.
Incubazione cellulare
Incubare le cellule seminate in un incubatore umidificato a 37 ° C con CO2 al 5% per almeno 24 ore prima della trasfezione per consentire alle cellule di attaccare e recuperare dal processo di semina.
Eseguire la trasfezione
Una volta preparate le cellule, è tempo di eseguire la trasfezione. Ecco un protocollo generale per la trasfezione a base di lipidi delle cellule TET-213:
Preparare il reagente di trasfezione
Seguire le istruzioni del produttore per preparare il reagente di trasfezione a base di lipidi. In genere, ciò comporta diluire il reagente in un mezzo di trasfezione adatto.
Preparare l'acido nucleico
Preparare l'acido nucleico da trasfettare, come il DNA plasmidico o il siRNA. Diluire l'acido nucleico in un mezzo di trasfezione adatto.
Forma il complesso di trasfezione
Mescolare il reagente di trasfezione diluito e l'acido nucleico diluito in un tubo e incubare a temperatura ambiente per 15-30 minuti per consentire la formazione del complesso di trasfezione.
Aggiungi il complesso di trasfezione alle cellule
Rimuovere il terreno di coltura dalle cellule e sostituirlo con mezzo di trasfezione fresca. Aggiungi il complesso di trasfezione alle celle a discesa e turbina delicatamente la piastra per distribuire uniformemente il complesso.
Incubare le cellule
Incubare le cellule trasfettate in un incubatore umidificato a 37 ° C con CO2 al 5% per il tempo appropriato di tempo, a seconda del tipo di acido nucleico e dell'esperimento. Per la trasfezione del DNA plasmidico, un tempo di incubazione di 24-48 ore è in genere sufficiente per consentire l'espressione genica.
Valutare l'efficienza della trasfezione
Dopo la trasfezione, è importante valutare l'efficienza della trasfezione per determinare se la trasfezione ha avuto successo. Esistono diversi metodi disponibili per valutare l'efficienza della trasfezione, tra cui:
Microscopia a fluorescenza
Se l'acido nucleico trasfettato codifica una proteina fluorescente, come GFP, è possibile utilizzare la microscopia a fluorescenza per visualizzare le cellule trasfettate. La percentuale di cellule fluorescenti può essere utilizzata come stima dell'efficienza di trasfezione.
Citometria a flusso
La citometria a flusso può essere utilizzata per quantificare la percentuale di cellule trasfettate in base all'espressione di un marker fluorescente o di un antigene della superficie cellulare. Questo metodo fornisce una misura più accurata e quantitativa dell'efficienza di trasfezione rispetto alla microscopia a fluorescenza.
Western blotting o qpcr
Se l'acido nucleico trasfettato codifica di una proteina di interesse, il blotting occidentale o il QPCR possono essere usati per rilevare rispettivamente l'espressione della proteina a livello di proteina o mRNA. Questo metodo può fornire informazioni sul livello di espressione genica e sulla funzionalità della proteina trasfettata.
Risoluzione dei problemi di trasfezione comuni
La trasfezione a volte può essere impegnativa e ci sono diversi problemi comuni che possono verificarsi. Ecco alcuni suggerimenti per la risoluzione dei problemi per problemi di trasfezione comuni:
Bassa efficienza di trasfezione
- Controlla la qualità e la quantità dell'acido nucleico. Assicurati che l'acido nucleico sia puro e di alta qualità.
- Ottimizzare le condizioni di trasfezione, come la concentrazione del reagente di trasfezione, il rapporto acido nucleico e reagente e il tempo di incubazione.
- Controlla la salute e la vitalità delle cellule. Assicurati che le cellule siano sane e che crescano attivamente prima della trasfezione.
- Prova un metodo di trasfezione o un reagente diverso.
Tossicità cellulare
- Ridurre la concentrazione del reagente di trasfezione o dell'acido nucleico.
- Ottimizzare le condizioni di trasfezione per ridurre al minimo il danno cellulare.
- Utilizzare un metodo di trasfezione o un reagente diverso che è meno tossico per le cellule.
Efficienza di trasfezione variabile
- Assicurati che le cellule siano seminate uniformemente e alla densità appropriata.
- Mescolare accuratamente il complesso di trasfezione prima di aggiungerlo alle celle.
- Incubare le cellule in condizioni coerenti per ridurre al minimo la variabilità.
Conclusione
La trasfezione delle cellule TET-213 può essere un processo impegnativo ma gratificante. Scegliendo il giusto metodo di trasfezione, preparando correttamente le cellule e seguendo il protocollo appropriato, è possibile ottenere elevate efficienze di trasfezione e ottenere risultati affidabili. In caso di domande o hai bisogno di ulteriore assistenza con la trasfezione cellulare TET-213, non esitare a contattarci. Siamo un fornitore leader di cellule TET-213 e possiamo fornirti cellule di alta qualità, reagenti di trasfezione e supporto tecnico.
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Riferimenti
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