Nel campo degli studi sugli enzimi proteolitici, i substrati peptidici svolgono un ruolo fondamentale. Queste molecole specializzate sono strumenti essenziali per i ricercatori che mirano a comprendere i complessi meccanismi della proteolisi, tra cui la specificità degli enzimi, la regolazione dell'attività e i modelli di scissione del substrato. In qualità di fornitore leader di substrati peptidici, ci impegniamo a fornire prodotti di alta qualità in grado di migliorare significativamente la vostra ricerca sugli enzimi proteolitici. In questo blog approfondiremo i dettagli su come utilizzare efficacemente i substrati peptidici negli studi sugli enzimi proteolitici.
Comprensione dei substrati peptidici
I substrati peptidici sono corte catene di amminoacidi progettate per imitare i substrati naturali degli enzimi proteolitici. Sono attentamente progettati per contenere le sequenze di aminoacidi specifiche riconosciute dalle proteasi bersaglio. Quando un enzima proteolitico incontra un substrato peptidico adatto, scinderà il substrato in un sito specifico, provocando il rilascio di prodotti di scissione. Questo evento di scissione può quindi essere rilevato e misurato utilizzando una varietà di metodi, fornendo preziose informazioni sull'attività e sulla specificità dell'enzima.
Selezione del substrato peptidico appropriato
Il primo passo nell'utilizzo dei substrati peptidici negli studi sugli enzimi proteolitici è selezionare il substrato giusto per le vostre specifiche esigenze di ricerca. Molti fattori dovrebbero essere considerati durante il processo di selezione.
Specificità enzimatica
Diversi enzimi proteolitici hanno specificità di substrato distinte, che sono determinate dalle sequenze di aminoacidi che circondano il sito di scissione. Ad esempio, la tripsina è una serina proteasi che scinde i legami peptidici sul lato carbossilico dei residui di lisina o arginina. Pertanto, quando si studia la tripsina, è necessario scegliere un substrato peptidico che contenga un residuo di lisina o arginina nella posizione di scissione appropriata. Offriamo una vasta gamma di substrati peptidici su misura per diversi enzimi proteolitici, come ad esempioZ - LLY - FMK CAS 133410 - 84 - 1, che è progettato per attività proteolitiche specifiche associate a determinati tipi di proteasi.
Metodo di rilevamento
Il metodo di rilevamento che intendi utilizzare influenza anche la selezione del substrato. Esistono diversi metodi di rilevamento comuni, tra cui fluorescenza, assorbanza e marcatura radioattiva. I substrati peptidici marcati con fluorescenza sono ampiamente utilizzati perché consentono il rilevamento sensibile e in tempo reale dell'attività enzimatica. La scissione di un substrato peptidico fluorescente determina un cambiamento nell'intensità della fluorescenza, che può essere facilmente monitorata utilizzando un lettore di fluorescenza. Ad esempio,Suc - IIW - AMCè un substrato peptidico fluorescente che può essere utilizzato per misurare l'attività di alcune proteasi. Quando il substrato viene scisso dall'enzima bersaglio, la porzione AMC viene rilasciata e la sua fluorescenza può essere rilevata a una lunghezza d'onda specifica.
Condizioni sperimentali
Condizioni sperimentali come pH, temperatura e forza ionica possono influenzare le prestazioni dei substrati peptidici e degli enzimi proteolitici. Alcuni enzimi sono attivi in specifici intervalli di pH e anche la stabilità dei substrati peptidici può essere influenzata da queste condizioni. Pertanto, è necessario scegliere un substrato compatibile con le condizioni sperimentali. Il nostro team di supporto tecnico può fornire informazioni dettagliate sulle condizioni ottimali per l'utilizzo dei nostri substrati peptidici per garantire i migliori risultati sperimentali.
Preparazione dei substrati peptidici
Una volta selezionato il substrato peptidico appropriato, il passo successivo è prepararlo per l'uso nei tuoi esperimenti. I passaggi generali per la preparazione del substrato sono i seguenti:
Dissoluzione
La maggior parte dei substrati peptidici vengono forniti sotto forma di polveri liofilizzate. Per scioglierli è necessario utilizzare un solvente appropriato. La scelta del solvente dipende dalle proprietà del substrato e dai requisiti dell'esperimento. Per i substrati peptidici idrosolubili, vengono comunemente utilizzate soluzioni tampone come la soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) o il tampone Tris - HCl. Per i substrati peptidici idrofobici possono essere necessari solventi organici come il dimetilsolfossido (DMSO). Tuttavia, è importante notare che elevate concentrazioni di solventi organici possono talvolta inibire l'attività enzimatica, pertanto la concentrazione finale del solvente nella miscela di reazione deve essere attentamente controllata.
Determinazione della concentrazione
Dopo la dissoluzione, è necessario determinare la concentrazione della soluzione del substrato peptidico. Questo può essere fatto utilizzando vari metodi, come la misurazione dell'assorbanza a una lunghezza d'onda specifica. Ad esempio, se il substrato peptidico contiene un gruppo cromogenico o fluorogenico con un coefficiente di estinzione molare noto, è possibile utilizzare la legge Beer-Lambert per calcolare la concentrazione del substrato in base alla lettura dell'assorbanza.
Conduzione di saggi enzimatici proteolitici
Con il substrato peptidico preparato, è ora possibile impostare analisi degli enzimi proteolitici. Ecco un protocollo generale per un tipico test enzimatico:
Impostazione della reazione
Preparare una miscela di reazione contenente il substrato peptidico, l'enzima proteolitico e un tampone di reazione appropriato. Il tampone dovrebbe fornire il pH e la forza ionica ottimali per l'attività enzimatica. La miscela di reazione viene solitamente incubata a una temperatura specifica per un periodo di tempo definito. La temperatura e il tempo di incubazione dipendono dalle caratteristiche dell'enzima e dagli obiettivi sperimentali. Ad esempio, alcuni enzimi sono più attivi a 37°C, mentre altri potrebbero richiedere temperature più basse o più alte.
Monitoraggio della reazione
Durante il periodo di incubazione è possibile monitorare l'andamento della reazione proteolitica. Se si utilizza un substrato peptidico fluorescente o cromogenico, è possibile misurare la variazione della fluorescenza o dell'assorbanza a intervalli regolari utilizzando uno strumento adatto. L'aumento o la diminuzione del segnale nel tempo riflette la scissione enzimatica del substrato.
Analisi dei dati
Dopo l'incubazione, analizzare i dati ottenuti dalla fase di monitoraggio. È possibile calcolare l'attività enzimatica in base alla velocità di scissione del substrato. L'attività enzimatica è solitamente espressa come la quantità di substrato tagliato per unità di tempo. Questo valore può essere utilizzato per confrontare le attività di diversi enzimi, studiare gli effetti degli inibitori enzimatici o indagare l'influenza di vari fattori sull'attività enzimatica. Ad esempio, se si sta testando l'effetto inibitorio di un composto su un enzima, è possibile misurare l'attività dell'enzima in presenza e in assenza dell'inibitore e calcolare la percentuale di inibizione.
Utilizzo di substrati peptidici per lo screening degli inibitori
Anche i substrati peptidici hanno un valore inestimabile negli studi di screening degli inibitori. Gli inibitori possono essere utilizzati per regolare l'attività enzimatica, studiare la funzione enzimatica e sviluppare potenziali agenti terapeutici. Per effettuare lo screening degli inibitori degli enzimi proteolitici utilizzando substrati peptidici, attenersi alla seguente procedura:
Preparare soluzioni di inibitori
Sciogliere i potenziali inibitori in un solvente appropriato a diverse concentrazioni. I solventi devono essere compatibili sia con l'inibitore che con il sistema di analisi enzimatica.
Impostazione dei test degli inibitori
Preparare miscele di reazione contenenti il substrato peptidico, l'enzima proteolitico e diverse concentrazioni dell'inibitore. Inoltre, includere una reazione di controllo senza l'inibitore. Incubare le miscele di reazione nelle stesse condizioni del normale test enzimatico.
Misurare gli effetti inibitori
Monitorare l'attività enzimatica in ciascuna miscela di reazione utilizzando lo stesso metodo di rilevamento descritto sopra. Confrontare le attività enzimatiche in presenza e in assenza dell'inibitore per determinare l'effetto inibitorio. È possibile tracciare una curva dose-risposta per calcolare il valore IC50, che rappresenta la concentrazione dell'inibitore necessaria per inibire il 50% dell'attività enzimatica. Composti comeInibitore della calpaina XI CAS 145731 - 49 - 3può essere utilizzato in tali test di screening degli inibitori e le nostre informazioni complete sui prodotti possono assistervi nella pianificazione e nell'esecuzione di questi esperimenti.
Conclusione
I substrati peptidici sono strumenti indispensabili negli studi sugli enzimi proteolitici. Selezionando attentamente il substrato appropriato, preparandolo correttamente ed eseguendo analisi enzimatiche ben progettate, i ricercatori possono ottenere preziose informazioni sui meccanismi della proteolisi. In qualità di fornitore di substrati peptidici, ci impegniamo a fornire prodotti di alta qualità e supporto tecnico professionale per soddisfare le vostre esigenze di ricerca. Che tu stia studiando la cinetica degli enzimi, effettuando lo screening per gli inibitori o esplorando nuovi bersagli terapeutici, i nostri substrati peptidici possono aiutarti a raggiungere i tuoi obiettivi di ricerca.
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Riferimenti
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