L'instabilità dei peptidi è uno dei principali problemi nella ricerca sulla formulazione e le ragioni di ciò sono molteplici. Ma non ci sono molte ragioni principali per l’instabilità di un certo peptide. Uno studio dettagliato degli effetti delle condizioni esterne (come pH, temperatura, luce, concentrazione di ossigeno, ecc.) sulla stabilità del peptide può aiutare a progettare una formulazione razionale. Sebbene il meccanismo attraverso il quale gli additivi stabilizzano i peptidi non sia ancora completamente compreso, l’uso degli additivi è ancora uno dei mezzi principali per migliorare la stabilità delle formulazioni peptidiche. L'applicazione di metodi analitici come CD e DSC può aiutare a individuare rapidamente gli additivi idonei.
Ragioni dell'instabilità del peptide:
Reazione di deammidazione: nella reazione di deacetilazione, i residui Asn/Gln vengono idrolizzati per formare Asp/Glu. Si effettua la reazione di deammidazione non enzimatica. I gruppi ammidici nella struttura Asn Gly vengono idrolizzati più facilmente e anche i gruppi ammidici situati sulla superficie della molecola vengono idrolizzati più facilmente di quelli all'interno della molecola.
Ci sono due ragioni principali per cui le soluzioni peptidiche sono soggette all'ossidazione: una è la contaminazione dei perossidi nella soluzione e l'altra è l'ossidazione spontanea dei peptidi. Tra tutti i residui aminoacidici, Met, Cys, His, Trp, Tyr, ecc. sono quelli più facilmente ossidabili. Anche la pressione parziale dell’ossigeno, la temperatura e la soluzione tampone hanno un impatto sull’ossidazione.
Idrolisi: I legami peptidici nei peptidi vengono facilmente idrolizzati e rotti. I legami peptidici formati da Asp si rompono più facilmente rispetto ad altri legami peptidici, in particolare i legami peptidici Asp Pro e Asp Gly.
Formazione di legami disolfuro errati: lo scambio tra legami disolfuro o tra legami disolfuro e gruppi tiolici può formare legami disolfuro errati, portando a cambiamenti nella struttura terziaria e perdita di attività.
Racemizzazione: ad eccezione di Gly, gli atomi di carbonio alfa di tutti i residui amminoacidici sono chirali e subiscono facilmente reazioni di racemizzazione sotto catalisi alcalina. Tra questi, i residui di Asp sono i più inclini alle reazioni di racemizzazione.
- eliminazione: - l'eliminazione si riferisce all'eliminazione dei gruppi funzionali sull'atomo di carbonio nei residui amminoacidici. Cys, Ser, Thr, Phe, Tyr ed altri residui possono essere degradati mediante eliminazione. - L'eliminazione avviene a pH alcalino e anche la temperatura e gli ioni metallici influiscono su di essa.
Denaturazione, adsorbimento, aggregazione o precipitazione sono generalmente legati alla distruzione delle strutture terziarie e secondarie. Allo stato denaturato, i peptidi sono spesso più soggetti a reazioni chimiche e la loro attività è difficile da ripristinare. Nel processo di denaturazione dei peptidi si formano prima gli intermedi. La solubilità degli intermedi è solitamente bassa, il che li rende facili da aggregare e formare aggregati, che a loro volta formano precipitati visibili ad occhio nudo.
L'adsorbimento superficiale delle proteine è un altro problema riscontrato durante la loro conservazione e utilizzo, come l'adsorbimento di riL-2 sulla superficie della tubazione durante la perfusione di Qu, causando una perdita di attività.